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Sep 29, 2023

Microscopia de iluminação estruturada de transmissão com iluminação de frequência ajustável usando montagem de espelho inclinado

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 1453 (2023) Citar este artigo 2076 Acessos 4 Detalhes da Altmetric Metrics Apresentamos demonstração experimental de transmissão assistida por espelho inclinado

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 1453 (2023) Citar este artigo

2076 Acessos

4 Altmétrico

Detalhes das métricas

Apresentamos demonstração experimental de microscopia de iluminação estruturada de transmissão assistida por espelho inclinado (tSIM) que oferece um grande campo de visão de imagens de super resolução. Um conjunto de espelhos inclinados personalizados é empregado como módulo de iluminação onde a amostra é excitada com a interferência de dois feixes refletidos do par oposto de facetas do espelho. Padrões estruturados de frequência sintonizável são gerados alterando o ângulo de inclinação do espelho e o arranjo hexagonal-simétrico é considerado para a resolução isotrópica em três orientações. A utilização da objetiva de alta abertura numérica (NA) no SIM padrão fornece comprometimento da super-resolução com o campo de visão (FOV). Empregando detecção de lente objetiva de baixo NA (20X/0,4), demonstramos experimentalmente uma imagem FOV de tamanho único \(\sim\) (0,56 mm\(\times\)0,35 mm) com \(\sim\)1,7- e \(\ sim\) Melhoria de resolução de 2,4 vezes (explorando várias iluminações ajustando espelhos de inclinação) acima do limite de difração. Os resultados são verificados tanto para as esferas fluorescentes quanto para as amostras biológicas. A geometria tSIM desacopla a iluminação e os caminhos de luz da coleção, permitindo, conseqüentemente, a mudança livre da lente objetiva de imagem sem influenciar a frequência espacial do padrão de iluminação que é definido pelos espelhos de inclinação. O FOV grande e escalável suportado pelo tSIM encontrará uso para aplicações onde a digitalização de grandes áreas é necessária, como em patologia e aplicações onde as imagens devem ser correlacionadas no espaço e no tempo.

Romper o limite de difração1,2 da microscopia de fluorescência clássica nas últimas duas décadas revolucionou os estudos biomédicos e levou a um novo campo de pesquisa denominado 'nanoscopia óptica'3,4. Na área de rápido progresso da nanoscopia, a microscopia de iluminação estruturada (SIM) aparece como uma técnica significativa de super-resolução de campo amplo, onde uma série de padrões estruturados são empregados para excitar a amostra fluorescente e os quadros Moiré brutos correspondentes são processados ​​computacionalmente para alcançar um aumento de resolução de cerca de duas vezes acima do limite de campo amplo. Apesar de oferecer aumento de resolução relativamente moderado em comparação com outras técnicas de super-resolução óptica, como depleção de emissão estimulada (STED),8,9 microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM),10,11 microscopia de localização fotoativada (PALM), 12,13 ou depleção do estado fundamental (GSD),14,15 O SIM atraiu considerável atenção devido à sua alta resolução espaço-temporal, baixa fototoxicidade, compatibilidade com marcação fluorescente comum, imagem multicolorida eficiente16,17 e assim por diante. Também é considerada uma abordagem promissora para a investigação da dinâmica subcelular de células vivas por exigir menor número de quadros brutos e baixa dose de fótons. Embora o padrão de excitação estruturado sinusoidal seja a principal característica para obter imagens de resolução superior através do SIM, ele não está mais restrito aos padrões de iluminação periódicos. Iluminações aleatórias semelhantes a manchas com abordagens de reconstrução cega também são implementadas com sucesso para a imagem SIM. No entanto, os métodos de iluminação aleatória oferecem super-resolução ao custo de baixa resolução temporal devido à exigência de um grande número de quadros (\(\sim\)100s). Esses métodos eliminam o tema principal da imagem de iluminação estruturada periódica que minimiza o número necessário de quadros 9(15) em casos SIM 2D (3D), ainda menos em certos casos22,23 relatados recentemente. Portanto, valem a pena os esforços para melhorar ainda mais a resolução do SIM, mantendo os padrões de iluminação periódica bem definidos.

Na técnica SIM linear convencional, uma lente objetiva única é empregada para iluminar a amostra, bem como para coletar o sinal de fluorescência. Consequentemente, tanto a iluminação quanto a óptica de detecção são limitadas pela difração pela mesma lente objetiva, e o sistema é estritamente restrito para oferecer uma melhoria de resolução dupla em comparação com o limite de difração clássico. Para ultrapassar ainda mais o limite típico de resolução do SIM, existe a reflexão interna total fluorescente (TIRF) -SIM onde o padrão de interferência de alta frequência de ondas evanescentes ilumina a amostra. No entanto, a iluminação TIRF é restrita a uma seção óptica fina (<100 nm) e, portanto, trata apenas de imagens 2D. Além disso, as propriedades de saturação dos materiais fluorescentes são aproveitadas na abordagem não linear SIM26,27,28, que incorpora as contribuições de múltiplos harmônicos em imagens de super-resolução. No entanto, a exigência de alta intensidade para atingir o nível de saturação operacional dos fluoróforos pode proporcionar problemas de fototoxicidade para a abordagem não linear. Outras técnicas SIM baseadas em diferentes princípios também foram relatadas, por exemplo, plasmônico29,30, grade de projeção de proximidade31 ou chip fotônico32. Cada uma dessas técnicas requer materiais fotônicos ou plasmônicos sofisticados e dedicados para manipular o padrão de iluminação estruturado no plano da amostra. Além disso, são necessárias ferramentas especialmente projetadas para a mudança de fase e a orientação do padrão, por exemplo, termo-óptica para SIM de chip fotônico ou varredura galvo para SIM plasmônico. Em geral, estas técnicas são complexas devido à sua dependência do material dedicado; o que restringe a sintonização da frequência do padrão de iluminação. No SIM plasmônico, as estruturas de array pré-calibradas são fabricadas de acordo com a faixa de comprimento de onda operacional. A estrutura específica determina seletivamente a orientação e a frequência do padrão de iluminação, não há sintonia do padrão. Da mesma forma, no chip fotônico SIM, a frequência do padrão de iluminação é pré-decidida pelos ângulos dos braços do guia de ondas disponíveis. Finalmente, amostras convencionais em lâminas de microscópio ou lamelas não funcionam para estes métodos. É necessário preparar a amostra na superfície do material projetado que é iluminada pelo padrão de interferência de ondas estacionárias no regime evanescente, restringindo essas técnicas à super-resolução 2D-TIRF.