blog

Jun 28, 2023

Comparando tecnologia alternativa de purificação de vetores virais

Por Jack Vicalvi, cientista principal, J2 Biopharm Associates LLC Esta é uma visão geral de produtos e abordagens inovadores selecionados desenvolvidos durante os últimos 15 anos que contribuíram para

Por Jack Vicalvi, cientista principal, J2 Biopharm Associates LLC

Esta é uma visão geral de produtos e abordagens inovadores selecionados desenvolvidos durante os últimos 15 anos que contribuíram para melhorias que permitem a fabricação de terapêuticas de vetores virais com recuperações e purezas mais altas.

Esta é a segunda parte de uma série que analisa alguns avanços específicos da tecnologia de purificação. A primeira parte discutiu equipamentos e processos posteriores para anticorpos monoclonais.

Na segunda parte, examinamos como esses produtos podem mudar a forma como fabricamos essas terapêuticas de vetores virais, onde podem ser usados ​​nos esquemas atuais de desenvolvimento de processos e quais vantagens eles conferem em relação aos métodos anteriores. Abordamos a economia situacional que impulsiona o uso desses produtos ou abordagens inovadoras. Finalmente, nos concentramos em modelos de aumento de escala GMP para fins práticos: se não for dimensionado em GMP, não importa quão bem funcione no desenvolvimento.

Diagramas de fluxo de processos de vetores virais

O esclarecimento das colheitas de vetores virais é mais complicado do que o esclarecimento do mAb. A clarificação tradicional geralmente começa com centrifugação diferencial ou gradiente. Na melhor das hipóteses, isso pode ser problemático para a fabricação de GMP em escalas superiores a 100 L, uma vez que o tamanho da carga do lote da caçamba da centrífuga é geralmente pequeno (10 a 20 L); depois, há preocupações com geração, limpeza e validação de aerossóis, bem como custos de equipamentos de capital que podem ser empecilhos. Mesmo com uma etapa de centrifugação, a filtração profunda e a filtração estéril continuam necessárias. A utilização de filtros de profundidade carregados pode ser insustentável dependendo do vírus, uma vez que a maioria dos vírus está ligada a porções de carga aniónica. No entanto, na presença de NaCl 200 a 300 mM, muitos vírus não serão removidos por tais dispositivos, enquanto alguns HCP e ADN da célula hospedeira ainda estão ligados.

Vírus envelopados, como lentivírus e alfavírus, são mais lábeis e podem não se dar bem com a filtragem profunda. No entanto, os alfavírus são mais robustos e podem ser passíveis de filtração de profundidade normal e até mesmo carregada. Nestes casos, usamos Pall SupraCap 100 (4 a 2,1 µm), Pall HCDII (1,2 µm) e AcroPak 500 (0,8 a 0,45 µm) em série. As membranas Millipore DOHC, COHC e XOHC também podem ser utilizadas. O uso de filtros de 0,2 µm geralmente resulta em perdas significativas e deve ser evitado até a filtração final. É imperativo manter um sistema fechado asséptico durante o processamento.

Os vírus não envelopados mais populares, como adenovírus (AV) e vírus adeno-associados (AAV), podem ser esclarecidos usando filtros de profundidade carregados 3M na presença de NaCl de 180 a 250 mM. Usamos os filtros 05SP (10 a 2 µm) e 60SP (3 a 0,2 µm) em série para alfavírus não envelopados e alguns alfavírus envelopados.

O método tradicional para captura de vetores virais é o AIEX. Isto pode ser conseguido utilizando resinas ou membranas. Para vírus envelopados, a abordagem de membrana geralmente é melhor, pois é muito mais suave para o vírus do que o tortuoso caminho através de uma coluna compactada. Os dispositivos mais comuns empregados incluem o Pall Mustang Q, Sartorius Sartobind Q-STIC e o monólito BIA CIMultus. A maior desvantagem das membranas ou monólitos é a sua baixa capacidade, resultando na necessidade de utilização de múltiplos ciclos. Contudo, utilizar uma coluna com uma altura de leito curta (6 a 10 cm) também pode funcionar, com o benefício adicional de aumentar significativamente a capacidade sobre as membranas. Os vírus não envelopados comumente usados ​​podem ser capturados por dispositivos de resina ou membrana.

Um método alternativo é usar cromatografia de afinidade. Muitos vírus possuem locais de ligação à heparina em suas superfícies, incluindo vírus envelopados. Tivemos sucesso com Heparin HyperD como etapa de captura de um alfavírus após digestão e clarificação com nuclease M-SAN, resultando em >90% de recuperação com excelente remoção de hcDNA e redução significativa de HCP durante a operação da coluna a 450 cm/h. As resinas cerâmicas HyperD são operacionalmente semelhantes às resinas de poliestireno. Existem outros protocolos de purificação que incorporaram Cellufine Sulfate ou Capto DeVirS como etapa inicial de captura; essas resinas funcionaram bem na purificação de flavivírus.