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Feb 20, 2024

Microscopia de contraste de fase adaptativa para compensar o efeito meniscal

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 5785 (2023) Citar este artigo 1049 Acessos 1 Detalhes da Altmetric Metrics Este artigo foi atualizado O contraste de fase é um dos mais importantes

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 5785 (2023) Citar este artigo

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Este artigo foi atualizado

O contraste de fase é um dos métodos microscópicos mais importantes para tornar visíveis células transparentes e não coradas. As culturas celulares são frequentemente cultivadas em placas de microtitulação, constituídas por vários poços cilíndricos. A tensão superficial do meio de cultura forma uma lente líquida dentro do poço, fazendo com que as condições de contraste de fase falhem nas áreas mais curvas da borda, impedindo a observação celular. A microscopia de contraste de fase adaptativa é um método para aumentar fortemente a área observável, compensando opticamente o efeito do menisco. O anel condensador do microscópio é substituído por um LCD transmissivo para permitir alterações dinâmicas. Um prisma deformável cheio de líquido é colocado no caminho de iluminação. O ângulo da superfície do prisma é inclinado de forma adaptativa para refratar a luz transmitida, de modo que o ângulo tangencial da lente líquida possa ser compensado. Além da observação da imagem de contraste de fase, um divisor de feixe permite visualizar simultaneamente o anel do condensador e o deslocamento do anel de fase. Algoritmos analisam o deslocamento para ajustar dinamicamente o LCD e o prisma para garantir condições de contraste de fase. Experimentos mostram um aumento significativo na área observável, especialmente para poços pequenos. Para placas de 96 poços, mais de doze vezes a área pode ser examinada sob condições de contraste de fase em vez da microscopia de contraste de fase padrão.

A microscopia de contraste de fase proposta pela primeira vez em 1932 por Frits Zernike1 é um método amplamente utilizado para observar amostras biológicas porque pode tornar visíveis células transparentes e não coradas2. Devido à interferência, as mudanças de fase da luz que passa podem se tornar visíveis para aumentar o contraste em objetos semitransparentes.

Porém, suas aplicações são limitadas pelo efeito meniscal, que afeta principalmente amostras em microplacas com 96 ou mais poços3. Medições de referência mostraram que em placas de 6 poços, condições de contraste de fase podem ser encontradas em 25% (235 mm2 de 950 mm2) da área superficial do poço. Em placas de 96 poços, é de apenas 2,3% (0,84 mm2 de 36,3 mm2)4.

O contraste de fase é um método de microscopia de luz transmitida no qual um anel condensador é colocado no caminho do feixe de iluminação e a luz na objetiva é guiada através de um anel de fase (ver Fig. 1). Se a imagem do anel do condensador e o anel de fase se sobrepuserem, surgem condições de contraste de fase. As mudanças de fase ocorrem nas transições da amostra observada, como os limites das células, que são destacados opticamente. As condições de contraste de fase podem ser facilmente identificadas pelo efeito "halo", que é uma região com fundo escuro e bordas brilhantes ao redor de objetos que mudam de fase2,6.

Representação esquemática do caminho de iluminação em um microscópio de contraste de fase com diferentes posições de poços. (A) Caminho de luz simplificado através do microscópio (elementos não ativos, como espelhos defletores e placas de vidro, foram omitidos). (1) Fonte de luz (2) Anel condensador (3) Lente condensadora (5) MTP (6) Lente objetiva (7) Anel de fase (8) Espelho móvel (9) Lente Bertrand (10) Lente ocular (11) Câmera secundária ( 12) Lente tubular (13) Câmera principal. Ao mover o espelho (8), ele pode ser alternado entre o caminho de luz principal (I) e o caminho de luz secundário (II) para observar a sobreposição do anel de fase e do anel do condensador. (B) A luz passa pelo centro do poço. (B.1) Imagem de superposição do anel de fase e anel condensador. Eles se sobrepõem completamente. (B.2) Imagem de contraste de fase resultante da cultura celular. (C) Devido à curvatura da superfície em direção à borda do poço, o feixe de luz é refratado para longe do centro. (C.1) Na imagem de superposição, é visível o desvio entre o anel condensador (2) e o anel de fase (7). (C.2) A imagem celular resultante é assim obtida em condições de campo claro. As imagens (A.2) e (B.2) foram tiradas com uma objetiva 10x (Nikon CFI Plan Fluor DL ​​10XF) em um MTP de 6 poços.